تعریف تکنیک وسترن بلاتینگ

وسترن بلاتینگ ( پروتئین بلاتینگ، ایمونوبلاتینگ و  یا لکه گذاری) یکی از سه نوع تکنیک مولکولی بلاتینگ است که در آزمایشگاه های زیست شناسی سلولی و مولکولی بسیار پرکاربرد است. این نوع تکنیک بلاتینگ اغلب برای جداسازی، مشاهده و اندازه گیری پروتئین ها در یک ترکیب پیچیده استفاده می شود. وسترن بلات همچنین کمک می کند تا تغییراتی که در پروتئین رخ داده (تغییر در غلظت پروتئین- اضافه شدن یا کم شدن گروه های شیمیایی- تغییرات اتصالات بین پروتئین ها) شناسایی شوند.  در ادامه به توضبح کامل این تکنیک خواهیم پرداخت.

تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز برای انجام تکنیک وسرتن بلاتینگ را می توانید با قیمت مناسب و کیفیت بالا از رویان ایران، مرجع تخصصی فروش تجهیزات آزمایشگاهی، تهیه نمایید.

مراحل انجام تکنیک وسترن بلاتینگ

در پست های قبل، در مورد انواع تکنیک های بلاتینگ و کاربرد هرکدام در آزمایشگاه های زیست شناسی و ژنتیک صحبت کرده ایم. در این مقاله با تمرکز بر تکنیک وسترن بلاتینگ، با ذکر کامل جزییات دستورالعمل، تجهیزات مورد نیاز و کاربردها را شرح داده ایم. با استفاده از نکات گفته شده در این بخش تمام مشکلات و پرسش هایی که ممکن است در آزمایشگاه و حین کار با آن ها برخورد داشته باشید، برطرف خواهند شد.

در ادامه 4 مرحله استخراج پروتئین، الکتروفورز، لود روی صفحه و پیوند با آنتی بادی را ببرسی می کنیم.

روش استخراج پروتئین از نمونه

1. ابتدا نمونه بیولوژیکی را در ظرف کشت ریخته و به آن به آرامی بافر فسفات سالین (PBS) اضافه کنید. توجه داشته باشید که ظرف کشت باید در محیطی سرد قرار گرفته شود.
2. در مرحله بعد نمونه را داخل لوله های میکروسانتریفیوژ بریزید و آن را به مدت 5 دقیقه و با دور 1500 RPM داخل دستگاه میکروسانتریفیوژ قرار دهید و سپس مایع رویی جدا شده در لوله را خارج کنید.
3. در این مرحله 180 میکرولیتر بافر لیز کننده سلول به همراه 20 میکرولیتر مهار کننده پروتئاز به لوله اضافه کنید. سپس لوله را به مدت 30  دقیقه داخل انکوباتور با درجه دمایی پایین قرار دهید. پس از آن به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد و با دور 12000  RPMداخل سانتریفیوژ بگذارید.
4. در مرحله آخر مایع رویی را پس از سانتریفیوژ در لوله ای دیگر ریخته و در دمای پایین نگهداری کنید. اکنون می توانید غلظت پروتئین را با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیری کنید.

ژل الکتروفورز

در این فرآیند قرار است پروتئین ها بر اساس شکل، بار الکتریکی و وزن مولکولی از یکدیگر تفکیک شوند. این فرآیند به وسیله الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید و سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) قابل انجام است. برای دناتوره شدن پروتئین از دترجنت آنیونی سدیم دودسیل سولفات (SDS) استفاده می شود. داخل تانک الکتروفورز بافر بریزید و سپس ژل الکتروفورز آماده شده را درون آن قرار دهید. به دلیل وجود SDS بار همه پروتئین ها منفی شده و جداسازی تنها بر اساس اندازه پروتئین ها انجام می شود در واقع هرچه پروتئین اندازه کوچک تری داشته باشد با سرعت بیشتری از ژل عبور کرده و برعکس هرچه بزرگ تر باشد طی زمان بیش تری عبور می کند.

انتقال

پروتئین ها از ژل به صفحات نیتروسلولزی منتقل می شوند. در این حالت ژل بین صفحات نیتروسلولزی قرار می گیرد. سپس ژل به همراه صفحات نیتروسلولزی را داخل cassette بگذارید و درون تانک الکتروفورز قرار دهید. زمانی که میدان الکتریکی درون الکتروفورز اعمال شود پروتئین ها از ژل خارج شده و وارد صفحات نیتروسلولزی می شوند.

اتصال آنتی بادی

در این مرحله ابتدا آنتی بادی اولیه به صفحه متصل سپس آنتی بادی ثانویه نشاندار به آنتی بادی اولیه متصل می شود. اینگونه با شناسایی آنتی ژن سطحی پروتئین هدف به وسیله آنتی بادی، پروتئین مجهول شناسایی می شود.

کاربردهای وسترن بلاتینگ

علاوه بر مواردی که از کاربرد های تکنیک وسترن بلاتینگ ذکر شد، از این تکنیک می توان برای بررسی و کنترل مستمر پروتئین ها پس از انجام کلونینگ نیز استفاده کرد. همچنین وسترن بلاتینگ در تشخیص بیماری هایی نظیر HIV و برای یافتن آنتی بادی های ضد HIV نیز کاربرد دارد.

تفاوت اصلی وسترن بلات با دیگر روش های بلاتینگ

بر اساس نوع ماکرومولکول روش های مختلف بلاتینگ وجود دارد که در نوع وسترن بلاتینگ ماکرومولکول مورد هدف پروتئین می باشد اما در نورترن بلاتینگ هدف RNA و در ساترن بلاتینگ هدف DNA است.

خرید تجهیزات مورد نیاز برای وسترن بلاتینگ از رویان ایران

وسترن بلاتینگ یکی از تکنیک های پر کاربرد برای جداسازی پروتئین ها در آزمایشگاه های مولکولی است. شما می توانید تجهیزات مورد نیاز برای انجام این تکنیک از جمله الکتروفورز، منبع تغذیه الکتروفورز، اسپکتروفتومتر، سانتریفیوژ و انکوباتور را از رویان ایران مرجع فروش تجهیزات آزمایشگاهی کشور با کمترین هزینه و بهترین کیفیت خریداری کنید. همچنین می توانید هر روز هفته برای دریافت مشاوره رایگان و استعلام قیمت با کارشناسان ما تماس حاصل نمایید.