الکتروفورز
الكتروفورز تشکیل شده از دو کلمه Electro به معنای الـكتريكي و Phoresis به معناي حركت و انتـقال ذره تـشـكيل شـده است و در كل به معني حركت ذرات در يك مايع تحت تاثیر ميدان الكتريكي است که از شناخته شده ترین روش های آزمایشگاهی برای جداسازی بیومولکول ها به حساب می آید. به عنوان مثال می توان به وسیله روش الکتروفورز پروتئین های باردار و یا DNA را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی در میدان الکتریکی بوسیله منبع تغذیه الکتروفورز تفکیک کرد.
اجزای دستگاه الکتروفورز
- محفظه
- منبع تغذيه الكتريكي
- محيط پشتيبان
- معرف شيميايي
- گرمكن (انكوباتور)
- غلظت سنج
- آند (الکترود مثبت) و کاتد (الکترود منفی) که از جنس گرافيت يا پلاتين هستند.
کاربردهای الکتروفورز
- تعيين نقشه پپتيدي
- تعيين جرم مولكولي نسبي
- مشخص كردن غلظت پروتئين
- شناسايي تغييرات پروتئين و DNA
عواملی که بر سرعت حرکت ترکیبات در روش الکتروفورز تاثیر می گذارند
- اندازه و شکل یون
- بار الکتریکی خالص یون
- شدت میدان الکتریکی
- دماي محیط الکتروفورزي
DNA Ladder
DNA Ladder ، شامل طیف وسیعی از مارکرهای مولکولی است که به اندازه‌گیری سایز های مختلف DNA می پردازد.
همزمان با پيشرفت تكنيـك هـاي ژنتيـك مولكـولي (Molecular genetic) و دستكاري ژنتيك و نيز روش هاي تشخيصي براي بررسي اوليه قطعات حاصل از هـضم آنزيمـي، واكـنش زنجيـرهاي پليمـراز، بررسي وكتورهاي حاوي DNA مورد نظـر و سـاير روش هـاي مـورد اسـتفاده در ژنتيـك مولكـولي و بيوتكنولـوژي، بـه DNA ماركرهـاي استانداردي نياز مي باشد تا از طريـق مقايـسه ميـزان حركـت قطعـات شناخته شده آن طـي ژل الكتروفـورز بتـوان انـدازه قطعـات مجهـول حاصـل از آزمـايش را برحسب جفـت بـاز تخمـين زد. ماركرهـاي استاندارد مي توانند حاوي قطعاتي از DNA با اندازه هايي متنوع از چند جفت باز تا چند كيلوباز باشند.
يكي از ساده ترين راه هاي تهيـه DNA ماركر استفاده از الگوي هضم آنزيمي انواع فاژ يا پلاسميدهايي استکه نقـشه محل هـاي بـرش آن هـا توسـط آنـزيم هـاي انـدونوكلئاز محدودكننده مشخص مي باشد. قطعات حاصل توسـط ايـن روش بـه نوع آنزيم هاي اندونوكلئاز، تركيب بازي ژنوم و شرايط هضم آنزيمـي بستگي دارد. معمـولا بـه ماركرهـاي نوكلئيـك اسيدي توليد شده با اين شيوه، ماركر DNA گفته مي شود.
اين روش با وجود سادگي داراي كاستي هايي نيز مي باشد، از قبيل فقـدان الگـويي منظم براي افزايش طول قطعات، متغير بودن غلظت هر قطعه به خـاطر تفاوت در وزن مولكولي نسبي آن ها و نيز پيچيده بودن اندازه قطعـات به دليل اتفاقي بودن محل هاي بـرش آنزيمـي بـه نحـوي كـه بـه خـاطرسپاري طول و در نتيجه استفاده از آنها را با مشكل همراه مـي سـازد.
بنابراين براي افزايش دقت در تعيين اندازه و سـادگي اسـتفاده وجـود باندهاي فراوان با محدوده اندازه هايي منطقي و پركاربرد كه به صورت منظم و مساوي افزايش مي يابند، بسيار سودمند خواهد بـود.
بانـدهاي استاندارد بايد اين قابليت را داشته باشـند كـه بـا وضـوح برابـر قابـل تشخيص باشند، به اين نوع از ماركرهـاي نوكلئيـك اسـيدي معمـولا Ladder DNA گفته مي شـود كـه طراحـي و سـاخت آن ها توسـط شركت هاي توليدكننده محصولات بيوتكنولـوژي بـه صـورت صـنعتي انجـام مي گيـرد. توليـد Ladder هـاي DNA بـا ايـن خـصوصيات بـا شيوه هاي مختلفي امكانپذير اسـت، كـه از انـواع آن هـا مـي تـوان بـه استفاده از روش هاي مبتني بر واكنش زنجيرهاي پليمراز (PCR) اشـاره نمود. قطعات حاصل از اين راه قابل طراحي در انـدازه هـاي مطلـوب مي باشند.
اما مشكل اصلي اين روش پيچيدگي و هزينـه بـر بـودن آن به واسطه استفاده از چندين مجموعه پرايمر است كه هر يك بـه نوبـه خود نيازمند برنامه دهي منحصر بـه فـردي بـه ماشـين PCR بـوده و از طرفي هزينه ساخت تعداد زيادي پرايمـر بـه لحـاظ اقتـصادي مقـرون به صرفه نمي باشد.
زمان الکتروفورز از عواملی مانند اندازه، اختلاف جرمی که مولکول ها با هم دارند و مقدار ولتاژ تاثیر می پذیرد. به عنوان مثال اگر طول زمان الکتروفورز زیاد باشد، امکان این که مولکول ها از ژل خارج شوند وجود دارد و برعکس اگر طول این زمان کوتاه باشد، احتمالا باند ها روی هم می افتند و هم چنین اسمیرها غیر قابل تمایز می شوند.
مارکر های وزنی که به مارکر Ladder معروف هستند همگام با ران شدن نمونه ها به منظور تشخیص وزن مولکول های جدا شده ران می گردند. Ladder بر اساس جمعیت مولکولی که قرار است جدا شوند انتخاب می شوند . Ladder حاوی مارکرهای دارای وزن کمتر و نیز وزن بیشتر از مولکولی که قرار است تفکیک شود باشد.
معمولا یکی از چاهک های الکتروفورز به نمونه Ladder اختصاص داده می شود که از ترکیباتی همانند جنس نمونه مورد آزمایش تشکیل شده است.. با شروع شدن عمل الکتروفورز تعدادی باند در چاهک Ladder به وجود خواهد آمد که از مطابقت دادن نمونه مجهول با باند می توان وزن تقریبی نمونه مجهول را بدست اورد.
باند ژل الکتروفورز
هر جرم مولکولی خاص نشان دهنده یک مولکول DNA خاص است که با باند هایی نشان داده می شوند. باندهایی که در سمت راست و چپ این تصویر مشاهده می شوند، نشانگر ladder هستند.
منبع : رویان ایران | بزرگترین مرجع تخصصی تجهیزات آزمایشگاهی کشور
