راهنمای جامع عیب یابی PCR و بررسی اشکالات رایج

تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز، راهنمای کامل اصول و عیب یابی PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز که عموما با نام اختصاری واکنش PCR شناخته می شود، یکی از پر کاربرد ترین تکنیک ها در آزمایشگاه های زیست شناسی سلولی و ژنتیک است. اصول انجام واکنش PCR بسیار ساده است اما در عین حال بسیار مهم و موثر در آزمایشگاه های بیولوژی است. به طور معمول برای رسیدن به نتایج صحیح این واکنش نیاز به مهارت ویژه و دستگاه های گران قیمتی نیست. با این حال، اطلاعاتی که می توان به دست آورد و کاربرد آن به عنوان یک ابزار، آن را به یک تکنیک قدرتمند تبدیل می کند. اما در نظر داشته باشید که همیشه این واکنش یک فرایند ساده نیست و نیاز به آزمون خطا دارد. در این راهنما ما به بررسی برخی از راه های شناسایی مشکلات و اصول عیب یابی PCR خواهیم پرداخت.

ماده اولیه مناسب

در عیب یابی PCR مواد اولیه واکنش اولین موردی است که باید بررسی شوند. ماده اولیه اکثر واکنش های PCR شامل DNA یا cDNA خالص است. بدون در اختیار داشتن ماده اولیه خوب اهمیتی ندارد که از چه پروتکلی یا معرفی استفاده کنید. هر دو پارامتر غلظت و خلوص ماده اولیه بسیار مهم است. این دو پارامتر را می توان با استفاده از تکنیک های طیف سنجی مثل فرابنفش/مرئی یا فلورسانس کنترل کرد. ژل الکتروفورز نیز می تواند غلظت نمونه با توجه به شدت نوار و همچنین تجزیه شدن یا نشدن DNA نمونه با این روش مشخص می شود.

استفاده از آغازگر یا پرایمر های مناسب PCR

زمانی که از نمونه اولیه خود اطمینان پیدا کردید، باید به دنبال پرایمر مناسب واکنش PCR باشید. پرایمر بهینه واکنش  PCR معمولا باید طولی با 18 تا 30 جفت باز با تقریبا 50% محتوای GC داشته باشد. از آنجایی که پرایمرها باید در یک واکنش با هم کار کنند، مهم است که دمای ذوب مشابهی داشته باشند تا بهینه‌سازی چرخه PCR امکان پذیر شود. دمای ذوب تحت تأثیر عواملی مانند طول آغازگر و محتوای GC تغییر می کند.

بازهای A و T در DNA دو رشته ای با دو پیوند و بازهای G و C با سه پیوند به هم متصل می شوند. بنابراین، توالی‌های آغازگر حاوی نسبت بیشتری از باز‌های G و C دمای ذوب بالاتری خواهند داشت. همچنین افزایش طول آغازگر نیز باعث افزایش دمای ذوب می شود.

مجموعه‌ای از ابزارهای آنلاین موجود است که می‌توانند به شما در بهینه‌سازی مکان‌ها و ویژگی های پرایمر انتخابی کمک کنند. اگر ایرادی در واکنش وجود داشت برای عیب یابی PCR حتما توالی آغازگر را مجددا بررسی کنید.

انتخاب پلیمراز بر اساس کاربرد

طیف وسیعی از DNA پلیمرازها وجود دارد و انتخاب پلیمراز مناسب می تواند چالش برانگیز باشد. در این مرحله مهم است که کاربرد هایی که در ادامه واکنش با آن سروکار خواهید داشت را در نظر بگیرید و پلیمراز مناسب را اضافه کنید. به عنوان مثال چه اندازه از آمپلیکون را می خواهید امپلی فای کنید؟ آیا قبل از امپلی فای، واکنش شما برای مدت طولانی باقی خواهد ماند؟

پلیمرازهای مختلف طول آمپلیکون بهینه متفاوتی دارند، بنابراین انتخاب یک مورد مناسب مهم است. این اطلاعات معمولاً در سایت های فروشنده و در اطلاعات فنی ارائه شده برای پلیمرازها یافت می شود.

عیب یابی PCR با تغییر و کنترل بافر

اگر پس از بررسی تمام مراحل بالا باز هم مشکلی در واکنش وجود داشت، ناامید نشوید. هنوز راه های دیگری را هم می توانید آزمایش کنید. اکثر پلیمرازها با بافر مخصوص به خود عرضه می شوند. در صورت بروز مشکل برای عیب یابی PCR می توانید از کیت های بهینه سازی بافر موجود استفاده کنید. این کیت ها شامل طیف گشترده ای از غلظت ها و ترکیبات مختلف بافر ها هستند. بهتر است که تغییر بافر را به عنوان واکنش کنترلی در نظر بگیرید و نتایج را مقایسه کنید.

استفاده از درپوش های مناسب و اطمینان از بسته بودن کامل ظرف ها

شاید بدیهی به نظر برسد اما بسته بودن کامل تمام درز های ظرف واکنش PCR در روند واکنش تاثیر بسزایی دارد. در طول چرخه های واکنش PCR محیط واکنش چندین مرتبه به دمای تنظیم شده می رسد. این کار از هدر رفتن مواد واکنش طی چرخه های PCR، بروز آلودگی و ایجاد واکنش های جانبی جلوگیری می کند.

بهینه سازی دما در عیب یابی PCR

دستورالعمل استفاده از پلیمراز انتخابی برای ایجاد بهترین شرایط عملکرد آنزیم، همراه محصول ارائه می شود. با این حال، مناسب‌ترین دما برای مرحله آنیلینگ به وسیله دمای ذوب آغازگرهایی که استفاده می‌کنید، تعیین می‌شود. این دما معمولاً در محدوده 50 تا 65 درجه سانتی گراد قرار می گیرد.

بسیاری از دستگاه‌های PCR به مناطقی تقسیم می‌شوند که کمک به ایجاد طیف دمایی در قسمت های مختلف بلوک می کند. در واقع با چندین واکنش یکسان، طیفی از دماهای آنیلینگ را می توان در یک آزمایش بررسی کرد و نتایج را برای یافتن بهترین دما مقایسه کرد.

رعایت اصول اولیه PCR

عیب یابی PCR می تواند بسیار ساده باشد.گاهی مسائل ابتدایی تر مانند کالیبره نبودن سمپلر نتایج واکنش را تحت تاثیر قرار می دهد و با خطا مواجه می کند. آلوده شدن معرف ها نیز یکی از مشکلات رایج این واکنش است که با استفاده از معرف های تازه مشکل برطرف می شود.

جمع بندی عیب یابی PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز یک واکنش بسیار رایج و کاربردی است. در صورت رعایت اصول انجام این واکنش که در این مقاله به آن ها اشاره شد و تجهیزات آزمایشگاهی کالیبره و استاندارد خطا ها و ایرادات واکنش برطرف می شود. کارآزموده ترین پرسنل نیز نمی توانند با دستگاه ها و معرف های غیر استاندارد و فرسوده، این واکنش را بدون خطا انجام دهند. رویان ایران، مرجع تخصصی فروش تجهیزات آزمایشگاهی، انواع دستگاه های مورد نیاز آزمایشگاه های زیست شناسی و ژنتیک را با بهترین قیمت و کیفیت عرضه می کند. با کارشناسان ما در تماس باشید.