دستورالعمل استفاده از بافرها در HPLC

نقش مهم بافرها در کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا یا HPLC

بافرها نقش بسیار مهمی در جداسازی با دستگاه HPLC را ایفا می کنند. در واقع کوچک ترین اشکالی در تهیه و به گردش در آمدن بافر در ستون HPLC می تواند تمام نتایج جداسازی را تحت الشعاع قرار دهد. بنابراین فردی که مسئولیت آنالیز نمونه ها با دستگاه HPLC را دارد باید علاوه بر داشتن دانش کافی نسبت به دستگاه و نحوه عیب یابی دستگاه HPLC، درباره محلول سازی بافر ها و تاثیر pH بر کروماتوگرام ها آگاهی کامل داشته باشد. در این مقاله سعی شده است دستورالعمل استفاده از بافرها در HPLC و اهمیت آن ها را در این روش جداسازی از جنبه های مختلف بررسی کنیم.

تغییرات pH و تاثیرات آن بر جداسازی HPLC

تغییرات اسیدی یا بازی محیط نمونه بر یونیزاسیون مولکول های نمونه خصوصا در جداسازی HPLC فاز معکوس تاثیر زیادی می گذارد. در صورتی که نمونه از مولکول های غیر قطبی تشکیل شده باشد، تاثیر pH حداقل و ناچیز است. در مقابل مولکول های قطبی که در شرایط محیطی مختلف با ماهیت اسیدی یا بازی ظاهر می شوند، تغییرات pH اهمیت بسیاری دارد.

تاثیرات تغییر pH بر پیک های کروماتوگرام در HPLC

تغییرات pH حین فرایند جداسازی می تواند به طور مستقیم روی پیک های خروجی و نتیجه ای که به دست می آورید اثر گذار باشند. در واقع پیک ها می توانند در نتیجه افزایش یا کاهش pH به یک دیگر نزدیک، ادغام یا کاملا از هم دور شوند که نتیجه آن پهن شدگی کروماتوگرام و افزایش خطا است. بنابراین به دست آوردن pH بهینه و کنترل pH از طریق استفاده از بافر ها به بهبود جداسازی پیک های دارای همپوشانی و از طرف دیگر جلوگیری از پهن شدگی کمک می کند.

دستورالعمل استفاده از بافرها در HPLC و بررسی عوامل مهم کنترل pH

کنترل pH از طریق استفاده از بافرها در HPLC قابل انجام است. در ادامه مقاله به بررسی عوامل مهم در کنترل pH و دستورالعمل استفاده از بافرها در HPLC خواهیم پرداخت.

این عوامل شامل موارد زیر است که درباره نقش هر کدام به اختصار توضیحاتی ارائه شده است.

• انتخاب بافر مناسب
• pH بافر
• غلظت بافر
• حلالیت بافر

انتخاب بافر مناسب برای HPLC یا کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا

برای انتخاب بافر مناسب جداسازی HPLC باید به  pkaمحلول و ناحیه کات آف UV توجه داشت. ناحیه کات آف یووی یا UV cutoff area با نام اختصاری COA در اصل طول موجی است که در آن طول موج حلال ‌های مورد استفاده در HPLC می‌توانند تابش UV را جذب کنند. بنابراین هر نمونه ای مانند دارو ها می توانند تحت تاثیر این جذب انرژی قرار گیرند. این مورد حتی اگر تست های بلنک برای حذف تداخل های حلال نیز انجام شود، می تواند مشکل ساز باشد. بنابریان طول موج دتکتور نباید با نایحه کات آف UV بافر تداخل داشته باشد. برای هر محلول می توانید این طول موجود را در مراجع مطالعه کنید.

بر اساس یک قاعده کلی گفته می شود که pH بافر باید در محدوده 1± از pka باشد. با در نظر رگفتن این موضوع هر گونه تغییر pH منتفی می شود. با عنوان مثال یک با فر با pka برابر با 4.5 می تواند محدوده pH از 3.5 تا 5.5 استفاده شود.

غلظت بافر

به صورت کلی غلظت بافر در انجام متد های جداسازی HPLC بسیار مهم و اثرگذار است. بهترین غلظت بافر، کمترین غلظتی است که نتایج تکرار پذیر به دست می دهد. غلظت بالای بافر می تواند به شست و شو و خروج سریع تر نمونه های دارای مولکول های قطبی منجر شود.

طبق یک استاندارد کلی غلظت بافر ها نباید کمتر از 0.005 مولار باشند. زیرا غلظت پایین تر باعث می شود محلول به صورت یک بافر عمل نکند و فعال نباشد. از سوی دیگر ویسکوزیته بافر در نتیجه افزایش غلظت بافر افزایش پیدا می کند. این موضوع منجر به افزایش فشار برگشتی ستون می شود.

pH بافر

برای ستون های دارای سیلیکا، که بسیار رایج هستند، مهم است که pH در محدوده 2 تا 8 باشد. در pH پایین تر از 2 پیوندهای آلی تخریب می شوند. از طرف دیگر در pH های بالای 8 حلالیت سیلیکا افزایش پیدا کرده  و منجر به تخریب ساختار آن می شود.

حلالیت بافر

یکی دیگر از نکات حائز اهمیت بافرها در HPLC حلالیت کامل بافر در محیط نمونه حل شونده است. در غلظت های بالا احتمال ترسیب ذرات بافر در کنار جز آلی وجود دارد. این رسوب ها می توانند منجر به اختلال عملکرد در پمپ ها و مسدود شدن ستون ها شوند.

نقش بافرها در HPLC و جمع بندی نکات مهم

در این مقاله سعی شد مهم ترین نکات و دستورالعمل استفاده از بافرها در HPLC را بررسی کنیم. بافرها نقش کلیدی در جداسازی HPLC دارند. انتخاب بافر مناسب، محلول سازی دقیق و استفاده از محلول های تازه آماده شده می تواند بسیاری از اشکلات رایج کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا را برطرف کند. توجه داشته باشید که در صورت مشاده سوسپانسیون جامد و یا میکروارگانیسم ها مانند باکتری در محلول به هیچ عنوان نباید از بافر در HPLC استفاده کرد. برای تهیه بافرهای مناسب کاربر باید نسبت به محاسبات و نحوه محلول سازی کاملا مسلط باشد و حتما از pH متر دقیق و کالیبره استفاده کند.