کشت میکروب در هود لامینار و روش­های مختلف آن

کشت میکروب در هود لامینار

همان طور که می­دانید میکروب موجودی تک سلولی است که می­تواند تمام نیازهای حیاتی خود را بدون نیاز به سلول­های دیگر برطرف کند.

میکروب همانند دیگر موجودات زنده برای رشد و تکثیر به عواملی اعم از آب و غذا و مواد آلی و معدنی نیاز دارد که تمام این عوامل در محیطی به نام محیط کشت وجود دارند و بدین صورت میکروب در محیط کشت رشد می­کند. محیط کشت باتوجه به نوع کاربرد می­تواند به صورت مایع و جامد و حتی ژله­ای و نیمه جامد باشد. از انواع محیط کشت می­توان نوع  دست ساز و نوع طبیعی (داخل سلول بدن یک جانور) را نام برد.

 انواع محیط کشت

از انواع محیط­های کشت می­توانیم محیط کشت افتراقی، غنی کننده، انتخابی، اختصاصی، پایه و کامل را نام ببریم.

محیط کشت پایه و عمومی  (General Purpose Media/Basic Media) نسبت به دیگر محیط­های کشت ساده است و دارای آب و مواد مغذی است و معمولا در این نوع محیط کشت جداسازی اولیه میکروارگانیسم­ها و سلول­ها صورت می­گیرد.

محیط کشت غنی کننده ((Enrichment Media زمانی به کار می­رود که تعداد میکروب­ها در نمونه کم بوده و یا به دلیل وجود مقدار زیادی از میکروب­ها در نمونه، جدا کردن آن با مشکل همراه می­شود. در این نوع محیط کشت فاکتور رشد وجود دارد و به وسیله آن سلول برای رشد تحریک می­شود. از جمله محیط­های کشت غنی می­توان آگار خون و سرم لوفر را مثال زد.

محیط کشت افتراقی (Differential Media) یکی از محیط­های کشت کاربردی در زمینه­های بیولوژی است و طوری طراحی شده­ است که می­تواند توسط رنگ کلونی، باکتر­ی­های مختلف را تشخیص دهد. می­توان آگار نمک منیتول و آگار مک کانکی را به عنوان مثال­هایی از محیط کشت افتراقی نام برد.

محیط کشت کامل (Complete Media) همه­ی مواد لازم برای کشت و رشد باکتری­ها را دارد و چیزی حدوده 80% باکتری­ها می­توانند در این نوع از محیط کشت رشد کنند.

محیط کشت انتخابی ((Selective Media محیطی است که در آن بعضی از مواد دارای عاملی انتخابی هستند که آن عامل مخصوص کشت یا جدا کردن گروه خاصی از میکروب­ها است و معمولاً مانع از رشد میکروارگانیسم­های نامطلوب می­شود و بدین ترتیب میکروارگانیسم­های مطلوب رشد بیشتری پیدا می­کنند. می­توان آگار خون بلور بنفش و آگار تایرمارتین را به عنوان مثال­هایی از محیط کشت انتخابی نام برد.

محیط کشت اختصاصی (Special Media)

1. محیط کشت ترابری (Transport Media) این محیط برای جلوگیری از خشک شدن، رشد بیش از حد باکتری و آلودگی مورد استفاده قرار می­گیرد و اضافه کردن زغال سبب خنثی شدن عوامل منع کننده می­شود.
2. محیط کشت سنجش (Assay Media) که برای سنجش آنتی بیوتیک­ها، آمینواسیدها و ویتامین­ها استفاده می­شود.
3. محیط کشت بی­هوازی (Anaerobic Media) باکتری­های بی­هوازی برای رشد به محیطی با مقدار کمی اکسیژن نیاز دارند.

محیط کشت مایع( Liquid or Broth media)  این نوع محیط کشت فاقد آگار است به همین علت این محیط کشت به صورت جامد نیست. معمولاً میکروارگانیسم­ها در لوله آزمایش رشد می­کنند. لوله آزمایش باید در زاویه 30 درجه قرار گیرد و دهانه آن برای ضد عفونی شدن به وسیله شعله حرارت ببیند. درپوش لوله نیز باید ضد عفونی شود.

محیط کشت جامد (Solid media) نوعی محیط کشت است که در ترکیب آن 5/1 تا 2درصد آگار وجود دارد و به صورت جامد است و معمولاً میکروارگانیسم­ها در پلیت قرار می­گیرند.

کشت در محیط جامد در ارلن مایر به دو صورت عمودی و شیبدار صورت می­گیرد

1. کشت به صورت عمودی: در ابتدا چیزی  در حدود 5 الی 10 میلی لیتر از محیط کشت را در لوله ارلن ریخته و لوله ارلن را به صورت عمودی می­گذاریم و مدتی صبر می­کنیم ، پس از آن به وسیله سوزنی مخصوص، میکروارگانیسم مورد نظر را در مرکز و در عمق محیط کشت پخش می­کنیم.
2. کشت به صورت شیبدار: در این روش چیزی  در حدود 5 میلی لیتر از محیط کشت را در لوله آزمایش ارلن مایر میریزیم و لوله آزمایش را باید طوری قرار دهیم که محیط کشت شیبدار شود و پس از آن میکروارگانیسم مورد نظر را توسط سوزن مخصوص در محیط کشت پخش می­کنیم.
3. کشت در محیط جامد در ارلن مایر و در پلیت به روش­های خطی، دولایه و در سطح محیط صورت می­گیرد.
4. کشت خطی: در این روش می­توان  به وسیله فیلدوپلاتین میکرواگانیسم مورد نظر را به صورت خطی کشت داد.
5. کشت دولایه: در این روش سوسپانسیون باکتری را به محیط کشت اضافه می­کنند و پس از مدتی پلیت را به صورت برعکس قرار می­دهند تا قطره­های آب در سطح محیط قرار نگیرد.
6. کشت در سطح محیط: در این روش میکروارگانیسم مورد نظر را در سطح محیط کشت می­ریزند و سپس آن را در سطح محیط کشت پخش می­کنند.
7. محیط کشت نیمه جامد یا ژله­ای (Semi solid media):  این محیط با آگار با غلظت های 5 درصد یا کمتر تولید می­شود. محیطی است که در آن میزان آگار محیط­های جامد بیشتر از آگار ترکیب محیط رشد است. مثلاً محیط کشت SIM.

معمولاً این روش از کشت برای بررسی توانایی حرکت باکتری مورد استفاده قرار می­گیرد و به همین دلیل نمونه را با میله مخصوص وارد محیط کشت نموده و قبل از رسیدن به انتهای محیط کشت آن را خارح می­کنند.

برای تکثیر و رشد سلول، میکروب و باکتری محیط کشت باید اجزای زیر را دربرداشته باشد

• مواد مغذی: آمینواسید (که برای ساخت پروتئین استفاده می­شود)،  مواد آلی و منابع کربن به عنوان منبع انرژی (مثل گلوتامین و گلوگز)، ویتامین (که تاثیر مثبتی بر دوام و رشد سلول دارد) و مواد معدنی
• فاکتور رشد که سلول را برای رشد تحریک می­کند.
• گازهایی مثل CO₂  و O₂  
• هورمون­ها
• تنظیم کننده فشار اسمزی
• تنظیم کننده دما (در شرایط عادی 37 درجه سانتی گراد باشد)
• تنظیم کننده رطوبت (در شرایط عادی 95 درصد باشد )
• تنظیم کننده pH  (برای تنظیم  pH در محیط کشت از بافر استفاده می­شود)

نگهداری محیط­های کشت

اگر محیط کشت بلافاصله به کار نمی­رود باید در یک مکان خنک نگهداری شوند. این محیط­های کشت اگر برای مدت طولانی در دمای اتاق بمانند آب خود را از دست می­دهند و خشک می­شوند اما دریخچال با دمای 4 درجه سانتی گراد ماه­ها قابل نگهداری هستند.

نکاتی درباره کار با نمونه­های میکروبیولوژیک

هنگام استفاده از لوپ­های کشت باکتری، لوپ باید قطری در حدود 2 تا 3 میلی متر داشته باشد و حلقه آن کاملا بسته باشد تا پس از برداشتن نمونه و قبل از کشت دادن آن قطرات ریز از آن بر روی سطح نریزد.

نمونه­ها یا محیط­های کشت حاوی باکتری قبل از دور انداختن باید در ظرفی حاوی محول ساولن 10 درصد ریخته شوند و یا باید قبل از خروج از آزمایشگاه اتوکلاو شوند.

تیپ­ها و پیپت­های آلوده باید قبل از دور ریختن با ساولن 10 ضدعفونی شوند و سپس اتوکلاو شوند.

منبع : رویان ایران | بزرگترین مرجع تخصصی تجهیزات آزمایشگاهی کشور