مشکلات احتمالی و تکنیک های عیب یابی دستگاه HPLC
این یک واقعیت انکار ناپذیر است که دستگاه های کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) دستگاه هایی با تکنولوژی بسیار پیشرفته ای هستند. اما همین دستگاه های پیشرفته نیز گاهی اوقات دچار خطا ها و عیب هایی می شوند که ممکن است اپراتور دستگاه و پژوهشگران را با مشکلاتی مواجه کنند. در صورتی که پرسنل با عیب های احتمالی و نحوه برطرف کردن آن ها آشنایی لازم را داشته باشند، این مشکلات مانعی برای ادامه کار به وجود نخواهند آورد. این مقاله به شما کمک خواهد کرد به سرعت عیب یابی دستگاه HPLC خود را انجام دهید.
مشکلات احتمالی رایج در آنالیز های HPLC
مشکلاتی مانند فشار ستون، تغییرات شکل و محل پیک ها، تغییر رتنشن تایم یا زمان پایداری، نوسانات بیس لاین و نشتی ها در دستگاه های HPLC بسیار رایج هستند. به وجود آمدن این مشکلات باعث می شوند شما داده های استباه به دست بیاورید. در نهایت رفع نشدن این خطا ها منجر به هدر رفتن نمونه های گران قیمت، نمونه هایی که بسیار سخت به دست آمده اند، مواد مصرفی و مواد شیمیایی می شوند. همه این عوامل به طور مستقیم به هزینه های عملیاتی یک آزمایشگاه تاثیر می گذارند.
در نتیجه آگاه بودن به علل مشکلاتی که ممکن است در حین آزمایش ها به وجود بیاید و تکنیک های عیب یابی دستگاه HPLC برای افرادی که روزمره با این دستگاه کار می کنند، بسیار ضروری است.
در ادامه به دلایل بروز خطا های رایج و نحوه عیب یابی دستگاه HPLC خواهیم پرداخت.
فشار برگشتی ستون (Column backpressure)
فشار برگشتی ستون های کروماتوگرافی به دلیل تجمع ذرات یا میکروارگانیسم ها در ورودی یا داخل ستون، افزایش پیدا می کند.
برای حفظ فشار برگشتی ستون موارد زیر را رعایت کنید
- از محلول فاز متحرک تازه آماده شده و فیلتر شده استفاده کنید.
- برای جلوگیری از انسداد سوزن یا ستون، نمونه ها را پیش از استفاده فیلتر یا سانتریفیوژ کنید.(خصوصا نمونه های بیولوزیکی و مواد غذایی)
- بافر با غلظت مناسب تهیه کنید تا ترسیب اتفاق نیفتد.
- ستون ها را شست و شو دهید تا رسوب ذرات در ان ها باقی نمانند.
- فیلتر های ستون ها در زمان های مشخص تعویض یا تمیز کنید.
- اتصالات در مسیر جریان به خصوص قبل از ستون را بررسی کنید تا نشتی نداشته باشند.
- حجم کافی فاز متحرک را در هر ران وارد کنید.
- برای جلوگیری از ایجاد حباب هوا ددر مسیر، از حلال های گاززدایی شده استفاده کنید.
- فیلتر های ورودی ظرف حلال را تمیز نگه دارید.
- در صورت نوسانات فشار به دلیل تشکیل حباب های هوا در پمپ، پمپ را تمیز کنید و در صورت نیاز، چک ولو ها را تعویض کنید. برای جلوگیری از ورود هوا به پمپ از حلال های گاز زدایی شده استفاده کنید.
- در صورت امکان دمای ستون را چک کنید. بالا رفتن دمای ستون، امکان کاهش فشار را بیشتر می کند.
مشکلات مربوط به پیک ها
محل پیک ها، سطح زیر آن ها و شکلی که ظاهر می شوند در تحلیل نتایج به دست آمده تاثیر گذارند. مشکلاتی که باعث تشکیل پیک های دوشاخه یا پهن شده می شوند، در بحث عیب یابی دستگاه HPLC از اهمیت بالایی برخوردارند.
برای ثابت ماندن شکل پیک ها موارد زیر را رعایت کنید:
- pH فاز متحرک را برای به حداقل رساندن یونیزاسیون آنالیت ها و برهمکنش های ثانویه آنها با ستون تنظیم کنید.
- ظرف های حاوی فاز متحرک را بپوشانید تا از تبخیر آن و تغییر ترکیبات آن جلوگیری شود.
- از گارد های مخصوص ستون، برای جلوگیری از تجمع ذرات در سر ستون استفاده کنید.
- با استفاده از ویال های غیر فعال از هدر رفت جذبی آنالیت های قطبی جلوگیری کنید.
- در صورت خراشیدگی روتور/استاتور را تعویض و اینجکتور را تمیز کنید.
برای جلوگیری از شکافتگی پیک ها موارد زیر را رعایت کنید:
- برای جلوگیری از اور لود شدن و بهبود وضوح پیک های شستشوی همزمان، حجم های کمتری تزریق کنید.
- از فیلتر های مخصوص برای جلوگیری از گرفتگی ستون ها استفاده کنید. به طور دوره ای این فیلتر ها را تمیز و تعویض کنید.
- ممکن است ستون آسیب دیده باشد. درصورت نیاز تعویض یا شست و شو داده شود.
برای جلوگیری از پهن شدن پیک موارد زیر را رعایت کنید:
- در صورت امکان، نمونه را در یک مخلوط حلال مشابه با ترکیب فاز متحرک اولیه یا یک حلال ضعیف تر حل کنید تا از دیسپرس شدن نمونه جلوگیری شود.
- غلظت نمونه و حجم تزریق را برای جلوگیری از اضافه بار ستون تنظیم کنید.
- pH فاز متحرک را کاهش دهید تا از انحلال بستر های سیلیسی (که در pH بالا دیده می شود) که منجر به تشکیل حفره ها می شود، جلوگیری شود، زیرا امکان دیسپرس و پراکنده شدن نمونه وجود دارد.
- ستون را دوباره شست و شو دهید.
رفع مشکلات مربوط به بیس لاین (Base Line)
مشکلاتی که در این قسمت بحث می شوند مربوط به دستگاه های دارای دتکتور UV هستند.
- از آب درجه HPLC یا فوق خالص استفاده کنید. زیرا ناخالصی های جذب کننده تابش فرابنفش در آب می توانند باعث نویز دار شدن بیس لاین شوند.
- از فاز متحرک گاز زدایی شده برای استفاده کنید. زیرا حباب های هوا می توانند اسپایک هایی روی بیس لاین ایجاد کنند.
- احتمالا نیاز است لامپ UV را تمیز یا تعویض نمایید.
- قسمت های مختلف پمپ و چک ولو ها را تمیز یا در صورت نیاز تعویض کنید.
- برای جلوگیری از نویز دار شدن بیس لاین، ستون را در محلی قرار دهید که در معرض جریان هوا و تغییرات شدید دمایی نباشد.
- دمای ستون و فاز متحرک را بررسی کنید.
- از فاز متحرک و بافر فیلتر شده استفاده کنید.
پیشنهاد هایی برای به دست آوردن بهترین نتایج از دستگاه HPLC
برای آنالیز مداوم و بدون خطا، عیب یابی دستگاه HPLC بسیار مهم است. در حالی که این یک کار چالش برانگیز است، اما به ما کمک می کند تا درک عمیقی از سیستم و روش به دست آوریم. از آن جایی که پیشگیری همیشه بهتر از درمان است، اهمیت پیروی از روش‌های استاندارد، مدیریت دقیق ستون‌ها و نگهداری منظم سیستم را نمی‌توان نادیده گرفت.
