تعیین غلظت DNA و RNA با اسپکتروفتومتری  UV-Vis

اسپکتروفتومتری و تعیین غلظت DNA و RNA

در آزمایشگاه های زیستی و تحقیقاتی یکی از مراحل اساسی پس از استخراج DNA و RNA تعیین غلظت و خلوص این مولکول ها است. درواقع بدون دانستن غلظت اسیدهای نوکلئیک نتایج هیچ یک از آزمایش های ژنتیکی قابل اعتماد نخواهد بود. یکی از روش های پرکاربرد، سریع و قابل اعتماد برای تعیین غلظت DNA و RNA اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی (UV-Vis Spectrophotometry) است. با این روش فقط با اندازه گیری چهار طول موج کلیدی می توان غلظت و خلوص نمونه را مشخص کرد.

اهمیت اندازه گیری غلظت و خلوص DNA و  RNA

هنگامی که DNA یا RNA  از سلول ها یا بافت ها استخراج می شوند معمولا به موادی نظیر پروتئین ها، بافرها، فنول یا الکل آلوده است. این ناخالصی ها می توانند روی واکنش های زیستی مانند PCR،  سنتز cDNA، کلونینگ یا توالی یابی تاثیر منفی بگذارند و به همین دلیل لازم است پیش از استفاده از DNA یا RNA  استخراج شده غلظت دقیق اسیدهای نوکلئیک و درجه خلوص آن ها مشخص شود. این کار کمک می کند تا از مقدار ماده ای که وارد واکنش می شود اطلاع داشته باشیم و از نبود آلودگی در نمونه که باعث تاثیرات منفی در روند آزمایش می شوند و نتیجه تست ها و واکنش ها را تغییر می دهند اطمینان حاصل کنیم.

اصول اسپکتروفتومتری  UV-Vis

اسپکتروفتومتری بر پایه جذب نور توسط مواد در طول موج های مشخص کار می کند. هر ترکیب شیمیایی در طول موج خاصی از نور جذب نوری مشخصی دارد. به عنوان مثال برای اسیدهای نوکلئیک در طول ‌موج ۲۶۰ نانومتر بیشترین جذب رخ می‌ دهد. در حالی که پروتئین ‌ها در ۲۸۰ نانومتر و مواد شیمیایی مانند فنول در ۲۳۰ نانومتر جذب دارند. بنابراین با اندازه‌ گیری جذب در این طول ‌موج ‌ها می ‌توان هم غلظت DNA و RNA را به ‌دست آورد و هم میزان آلودگی نمونه را بررسی کرد.

قانون بیر لامبرت (Lambert-Beer Law)

بر اساس قانون لامبرت-بر (Lambert-Beer Law) جذب نوری مستقیما با غلظت ماده در ارتباط است:

A = ε × L × C

که در آن:

• A جذب نور
• ε ضریب جذب مولی
• L طول مسیر نوری
• C غلظت نمونه

در دستگاه ‌های استاندارد طول مسیر نوری ۱ سانتی ‌متر است و تنها کافی است مقدار جذب در ۲۶۰ نانومتر را بدانیم تا غلظت محاسبه شود.

محاسبه غلظت DNA و RNA

در اسپکتروفتومتری غلظت از رابطه‌ زیر به‌ دست می ‌آید:

C = A₂₆₀ × F

A₂₆₀  مقدار جذب در طول ‌موج ۲۶۰ نانومتر است وF  فاکتور ثابت برای نوع مولکول می ‌باشد. (ضریب استاندارد DNA دو رشته ای 50 µg/mL و RNA 40 µg/mL می باشد).

بررسی خلوص با نسبت‌ های جذب

پس از تعیین غلظت DNA و RNA برای اطمینان از خلوص نمونه باید نسبت ‌های جذب نوری بررسی شوند. اسیدهای نوکلئیک و اسیدهای آمینه‌ آروماتیک در طول ‌موج ۲۶۰ نانومتر بیشترین جذب نوری را نشان می ‌دهند در حالی که پروتئین‌ ها در طول‌موج ۲۸۰ نانومتر بیشترین جذب را دارند. بنابراین نسبت جذب در دو طول موج 260 و 280 نانومتر شاخص مهمی برای ارزیابی خلوص نمونه است. اگر این نسبت برای DNA برابر یا بیش از 1.8 و برای RNA برابر با بیش از 1.9 باشد نمونه از نظر آلودگی پروتئینی خالص محسوب می شود.

علاوه بر پروتئین‌ ها ترکیبات شیمیایی نیز می ‌توانند موجب آلودگی و کاهش خلوص نمونه شوند. این ترکیبات معمولاً در طول‌موج ۲۳۰ نانومتر بیشترین جذب را دارند. بنابراین نسبت جذب بین طول موج های 230 و 260 نانومتر نیز شاخص دیگری برای سنجش خلوص است. محدوده ایده آل 2 تا 2.5 است و نشان ‌دهنده‌ آن است که نمونه‌ DNA یا RNA فاقد آلودگی شیمیایی است و از کیفیت مناسبی برخوردار می ‌باشد در حالی که کاهشA₂₆₀/A₂₃₀  نشانه‌ حضور مواد شیمیایی است.

طول ‌موج ۳۲۰ نانومتر و قابلیت Background Correction

در محدوده طول موج 320 نانومتر  DNA و RNA جذب نوری ندارد در نتیجه هر جذب مشاهده ‌شده در این ناحیه ناشی از وجود ذرات معلق، حباب ‌های هوا و یا آلودگی سطح کووت است. بیشتر اسپکتروفتومترهای مدرن دارای قابلیت Background Correction  هستند و به ‌صورت خودکار این خطاها را حذف می‌ کنند.

نکات کلیدی برای اندازه‌ گیری دقیق

• کووت یا پلتفرم دستگاه باید کاملا تمیز و خشک باشد.
• برای صفر کردن دستگاه از آب دو بار تقطیر یا بافر خالص استفاده کنید.
• از تشکیل حباب در نمونه جلوگیری کنید.
• اندازه ‌گیری چند باره و میانگین ‌گیری از نتایج خطای تصادفی را کاهش می ‌دهد.

ویژگی‌ های اسپکتروفتومتر  UV-Vis

• نیاز به حجم بسیار کم نمونه (۲ تا ۳ میکرولیتر)
• نمایش فوری نتیجه روی صفحه
• اتصال USB و Wi-Fi برای ذخیره و انتقال داده
• نرم‌افزارهای تحلیلی برای محاسبه‌ خودکار نسبت ‌ها
• گزینه تصحیح خودکار (Background Correction)

کاربردهای عملی اسپکتروفتومتری در آزمایشگاه

تعیین غلظت DNA و RNA  در مراحل مختلف تحقیقاتی اهمیت دارد، از جمله:

• برای انجام PCR و Real-Time PCR لازم است غلظت DNA الگو با دقت مشخص شود.
• در RNA-seq و سنتز  cDNAخلوص RNA از اهمیت بالایی برخوردار است و وجود حتی مقدار کمی DNA ژنومی یا پروتئین می ‌تواند کل نتایج را تغییر دهد و مشکل ساز باشد.
• در مطالعات مهندسی ژنتیک، کلونینگ، ترنسفکشن و سیستم‌ های  CRISPR فقط DNA با خلوص بالا می ‌تواند وارد سلول یا وکتور شود.
• کنترل کیفیت (QC) در صنایع زیستی و تولید کیت‌ ها

خرید دستگاه اسپکتروفتومتر از رویان ایران

اسپکتروفتومتری روشی است که به ‌طور هم ‌زمان سرعت، دقت و سادگی را در اختیار پژوهشگر قرار می ‌دهد.
این فناوری در کمتر از چند دقیقه می ‌تواند اطلاعات کاملی از غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک ارائه دهد، بدون آن‌که نیاز به مواد شیمیایی یا مراحل پیچیده داشته باشد. رویان ایران مرجع تخصصی توزیع تجهیزات آزمایشگاهی در کشور این دستگاه کاربردی در آزمایشگاه های زیست شناسی را با بهترین هزینه و با تضمین کیفیت دستگاه به سراسر کشور به فروش می رساند. می توانید برای دریافت اطلاعات بیشتر و استعلام قیمت با کارشناسان رویان ایران تماس حاصل نمایید.