4 پارامتر مهم در بهینه سازی PCR

طراحی PCR بهینه و پارامتر های مهم آن

اختراع واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) زمینه ای را برای پیشرفت در تحقیقات زیست پزشکی به وجود آورد و به دلیل کاربرد های متعدد به ابزاری حیاتی برای محققان و متخصصان بالینی تبدیل شد. یک واکنش موثر PCR نیازمند دانش کافی از هر جزء واکنش و آگاهی از روش گام به گام برای دستیابی به نتایج بهینه است. بنابراین بهینه سازی PCR بخشی از مراحل انجام این آزمایش است و به صورت مستقیم می تواند بر نتایج به دست آمده تاثیر بگذارد.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک بیولوژی مولکولی است که برای تولید نسخه ‌های متعدد از یک قطعه DNA خاص استفاده می ‌شود. این روش برای اولین بار توسط کری مولیس در سال 1985 نشان داده شد اما فرآیند اولیه توسط Kleppe و همکاران توصیف شد.

پیشتر به تفصیل درباره تکنیک PCR، کاربرد های آن و روش های عیب یابی PCR بحث کرده ایم. در مقاله پیش رو به بررسی مهم ترین پارامتر ها در بهینه سازی PCR پرداخته ایم.

کاربردهای PCR

PCR کاربردهای متعددی دارد و به طور گسترده در تحقیقات زیست پزشکی، پزشکی قانونی، انگشت نگاری DNA، توالی یابی DNA، تجزیه و تحلیل ژنتیکی، شبیه سازی مولکولی، تشخیص مولکولی و غیره استفاده می شود.

مراحل انجام PCR

مراحل PCR شامل سه بخش است:

• دناتوراسیون: در این مرحله حرارت تا 94 درجه سانتی گراد بالا برده می شود تا دو رشته DNA از یکدیگر جدا شوند.
• آنالینگ: برای این مرحله دما را در محدوده بین 55 تا 65 درجه سانتی گراد پایین می آوریم. پرایمر ها در این مرحله مکمل با رشته خودشان متصل می شوند.
• گسترش یا افزایش طول: آنزیم Taq polymerase در این مرحله در دمای 72 درجه سانتی گراد سر OH^ʹ3پرایمر را شناسایی می کند و شروع به طویل سازی رشته می کند.

مواد و ابزار های مورد نیاز برای PCR

• نمونه DNA به عنوان الگو
• آب
• بافر
• منیزیم
• نوکلئوتید های dNTP
• پرایمر Reverse
• پرایمر Forward
• آنزیم Taq polymerase
• میکروتیوب
• سمپلر

منظرو از بهینه سازی PCR چیست؟

با در نظر گرفتن اجزای مختلف واکنش مورد نیاز برای راه اندازی موفق PCR بهینه،  پارامتر های زیر باید ابتدا قبل از شروع آزمایش PCR، برای دستیابی به نتایج بهینه مورد توجه قرار گیرند.

بهینه سازی PCR نیازمند تعادل ظریف بین بالا بردن تولید محصولات خاص و اجتناب از تولید محصولات غیر اختصاصی و فرعی است. در یک مطالعه که نتایج آن نیز در یکی از مطرح ترین ژورنال ها به چاپ رسیده است، پارامتر های که بر کارایی و ویژگی تکثیر DNA تأثیر می‌گذارند، مورد ارزیابی قرار گرفته اند. جمع بندی نتایج این مطالعه را در ادامه آورده شده است.

 پارامترهای ارزیابی شده عبارتند از: دمای دناتوراسیون، آنالینگ و گسترش، تعداد چرخه های انجام شده، و غلظت های پرایمر، کلرید منیزیم، dNTP، Taq DNA پلیمراز و الگوی DNA. البته لازم به توضیح است که اهمیت غلظت DNA به منبعی که DNA از آن استخراج شده است بستگی دارد.

پارامترهای مهم برای بهینه سازی PCR

در ادامه 4 مورد از مهم ترین پارامتر های بهینه سازی PCR معرفی و درباره نقش هر کدام فرایند واکنش بحث شده است.

طراحی پرایمر

پرایمرها رشته های کوتاهی از توالی های DNA هستند که برای شروع PCR مورد نیاز هستند. تکثیر توالی های DNA هدفمند نیاز به یک نقطه شروع برای مرحله افزایش طول واکنش دارند. برای انجام موفقیت آمیز هر PCR، باید مجموعه ای از پرایمر های مناسب آن طراحی شود.

dNTP ها

دئوکسی ریبونوکلئوزید های 5′- تری فسفات (dNTPs) به عنوان یک سوبسترا برای DNA پلیمراز دخیل در تقویت توالی های DNA هدف عمل می کنند. dNTP ها ممکن است در یک مخلوط همگن باشند یا به طور جداگانه ارائه شوند و غلظت آن ها بین 20 میلی مولار تا 200 میلی مولار باشد. dNTP ها باید به مقدار مساوی اضافه شوند. در غیر این صورت، وجود یک dNTP در نسبت بالاتر ممکن است منجر به ادغام باز اشتباه در رشته DNA تازه سنتز شده شود. برای بهینه سازی PCR، غلظت dNTPs باید متناسب با غلظت MgCl₂ افزایش یابد.

DNA پلیمراز

آنزیم پلیمراز مهم ترین جزء آزمایش PCR است. Taq DNA پلیمراز در تقویت DNA الگو نقش دارد. این آنزیم dNTP ها را در طول طویل شدن در رشته DNA تازه سنتز شده ترکیب می کند. هنگام افزایش غلظت پلیمراز برای دستیابی به بهینه سازی باید مراقب بود، زیرا ممکن است به دلیل تقویت غیر اختصاصی DNA پلیمراز منجر به تشکیل لکه شود.

MgCl₂

منیزیم کلراید به عنوان یک عامل کمکی برای طویل شدن قالب انجام شده توسط Taq DNA پلیمراز عمل می کند. اکثر آزمایش های نا موفق PCR را می توان با تغییر غلظت MgCl₂ در مخلوط واکنش بهینه کرد و بهترین نتایج را به دست آورد. MgCl₂ همچنین با سایر اجزای مخلوط واکنش مانند الگوی DNA، dNTPs در تعامل است. همچنین ممکن است منیزم کلراید ضمن افزایش پایداری DNA، دمای ذوب را افزایش دهد. غلظت پایین یون مثبت در محلول ممکن است واکنش PCR را با شکست مواجه کند یا منجر به تقویت ناقص شود. در حالی که غلظت بالای یون منیزیم ممکن است منجر به پایداری رشته DNA شود و از آنالینگ پرایمرها به یک الگو جلوگیری کند و منجر به شکست واکنش یا تکثیر محصولات غیر اختصاصی شود.

اهمیت تجهیزات آزمایشگاهی در انجام واکنش PCR  بهینه

همچنان  تخصص و مهارت فردی که این آزمایش را انجام می دهد، بسیار مهم است. اما نمی توان نقش تجهیزات آزمایشگاهی استاندارد و کالیبره را در دقیق و صحیح انجام شدن واکنش نادیده گرفت. بنابراین پیش از انجام آزمایش از سلامت و کالیبره بودن تجهیزات آزمایشگاهی مورد استفاده، اطمینان حاصل کنید. رویان ایران، مرجع تخصصی فروش تجهیزات آزمایشگاهی، تمام دستگاه ها و تجهیزات مورد نیاز را با بهترین قیمت و کیفیت به فروش می رساند. برای استعلام قیمت و خرید محصولات با کارشناسان ما تماس حاصل فرمایید.