مروری بر تکنیک ساترن بلات برای شناسایی توالی DNA

ساترن بلاتینگ یا Southern Blotting یک روش آزمایشگاهی است که به کمک آن می توان توالی های DNA خاص را در یک نمونه شناسایی کرد. این روش به نام مخترع آن، زیست شناس بریتانیایی ادوین ساترن که اولین بار این روش را در سال 1975 ابداع کرد، گرفته شده است. ساترن بلات اغلب در آزمایش های زیست شناسی مولکولی برای کاربردهایی مانند اندازه گیری قطعه های DNA، تشخیص وجود یا عدم وجود یک توالی خاص DNA، آنالیز بیان ژن و سایر آزمایش های ژنتیکی و بیماری های ارثی مورد استفاده قرار می گیرد.

در این پست، اصول ساترن بلات، دستورالعمل کاملی از نحوه انجام آن، تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز و مقایسه این تکنیک با سایر تکنیک های بلاتینگ بررسی می شوند.

تکنیک ساترن بلاتینگ در یک نگاه

روش ساترن بلاتینگ بر مبنای جداسازی فرگمنت های DNA با استفاده از الکتروفورز ژل روی ژل آگارز انجام می شود. در ادامه DNA به صورت بلات یا لکه روی غشایی از جنس نایلون یا نیتروسلولز منتقل می شود. سپس از یک پروب DNA یا RNA نشاندار شده که مکمل توالی DNA هدف است. پس از هیبرید شدن پروب با توالی هدف می توان از اتورادیوگرافی، فلورسانس یا کمی لومینساسن برای تشخیص پروب تارگت استفاده کرد.

پروتکل انجام ساترن بلات در 9 مرحله

تکنیک ساترن بلاتینگ شامل 9 مرحله است. این مراحل عبارتند از استخراج DNA از نمونه، آنزیم هضم محدود کننده، الکتروفورز ژل، دناتوره کردن DNA، انتقال به غشا، پری هیبریداسیون یا بلاکینگ، هیبریداسیون، شست و شو و دتکت کردن یا تشخیص و آنالیز نهایی. در ادامه به ترتیب نحوه انجام هرکدام از این مراحل و تجهیزات و دستگاه های مورد نیاز شرح داده می شود.

استخراج DNA

در اولین مرحله باید DNA از نمونه در دسترس را به دست آورید. استخراج DNA از خون، بافت یا سلول ها انجام می شود. با این روش DNA با جرم مولکولی بالا به دست می آید. همچنین نمونه DNA به دست آمده به وسیله استخراج از دناتوره شدن آن جلوگیری می کند.

استفاده از آنزیم هضم محدود کننده

اندونوکلئازهای محدود کننده برای برش رشته‌های DNA با وزن مولکولی بالا به قطعات کوچک‌تر استفاده می‌شوند. همیشه به خاطر داشته باشید که مقادیر بافر، آنزیم و زمان های لازم برای انکوباسیون را طبق دستورالعمل های شرکت های سازنده انجام دهید.

PCR تعداد قطعات DNA به دست آمده از هضم محدود را که به راحتی با استفاده از الکتروفورز ژل جدا می شوند، تقویت می کند.

الکتروفورز ژل

برای جداسازی قطعات DNA براساس اندازه، نمونه DNA دایجست شده با آنزیم روی ژل معمولا آگارز یا پلی آکریل آمید لود و سپس الکتروفورز انجام می شود. ژل ها با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی می شوند تا امکان تصویربرداری در زیر نور UV فراهم شود.

دناتوره کردن DNA

DNA به دست آمده به صورت دو رشته ای است. از محلول های بازی برای دناتوره کردن قطعات محدود کننده در ژل استفاده می شود که DNA دو رشته ای را به تک رشته تبدیل می کند. هر گونه RNA باقیمانده را که ممکن است هنوز در DNA وجود داشته باشد از بین می برد. برای جلوگیری از هیبریداسیون مجدد، از NaCl استفاده می کنیم تا DNA خنثی شود. دناتوره شدن در یک محیط بازی پیوند DNA با بار منفی را به یک غشای با بار مثبت بهبود می بخشد.

اگر قطعات DNA بزرگ تر از 15 kb باشند، قبل از بلات کردن ممکن است لازم باشد ژل آغشته به HCl شود. اسید کمک می کند تمام قطعات DNA خارج کند و DNA را به قطعات کوچکتر می شکند. بنابراین انتقال کاملا موثر انجام می شود.

انتقال

ورقه ای از جنس نتیروسلولز یا نایلون در قسمت بالایی یا پایینی ژل (با توجه به جهت انتقال) قرار می گیرد. برای اطمینان از تماس خوب و یکنواخت بین ژل و غشا، فشار به طور یکنواخت به ژل اعمال می شود. برای انتقال DNA از ژل به غشا از بافر استفاده می شود. انتقال بافر طبق اصل کپیلاری از ناحیه ای با پتانسیل آب بالا به ناحیه ای با پتانسیل آب کم (معمولاً کاغذ صافی و غشا نیتروسلولزی) انجام می شود. DNA و غشا می توانند با یکدیگر پیوند یونی برقرار کنند. زیرا DNA دارای بار منفی و غشا دارای بار مثبت است.

سپس غشا باید داخل آون آزمایشگاهی یا آون خلا برای مدت 2 ساعت در دمای 80 درجه سانتی گراد قرار گیرد. البته قرار دادن غشا در معرض تابش UV باعث می شود لکه سریع تر تثبیت شود.

پری هیبریداسیون یا بلاکینگ

در پروسه انجام ساترن بلاتینگ مرحله بلاکینگ بسیار مهم است. زیرا در این مرحله پیوندهای غیر اختصاصی به غشا کاهش پیدا می کند. محلول پری هیبریداسیون را آماده کرده و نمونه DNA را اضافه کنید. بلات را از کراس لینک جدا کرده، محلول پری هیبریداسیون را اضافه کرده و انکوبه کنید.

هیبریداسیون

پروب که در واقع یک قطعه DNA با توالی خاص (رشته DNA مکمل) است، به DNA هدف هیبرید می شود. پروب با استفاده از رنگ لورسنت، ترکیب رنگزا یا ماده رادیواکتیو برچسب گذاری می شود. قبل از انکوباسیون غشا، محلول پروب را با بافر هیبریداسیون رقیق کنید.

شست و شو

پروب هایی که پیوندی تشکیل نداده اند با استفاده از باقر شست و شو از غشا خارج می شوند.

دتکت کردن یا تشخیص

پس از شست و شو، غشا در معرض مواد شیمیایی خاصی قرار می گیرد. به این ترتیب به کمک رادیوگرافی با اشعه ایکس (اتورادیوگرافی)، کمی لومینساس یا فلورسانس سیگنال ها قابل تشخیص خواهند بود. اگر از روش تشخیص کروموژنیک استفاده شود، می‌توانیم شاهد ایجاد رنگ بر روی غشا باشیم.

کاربردهای ساترن بلات

• شناسایی DNA خاص از یک نمونه DNA
• بررسی عفونت های ویروسی و باکتریایی
• مطالعه جهش ژن، حذف و بازآرایی آن ها
• ژنتیک پزشکی و بررسی ژنوم سرطان و تشخیص بیماری های ژنتیکی

خرید تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز ساترن بلاتینگ از رویان ایران

ساترن بلاتینگ یکی از تکنیک های بسیار پرکاربرد در آزمایشگاه های طراحی دارو و واکسن، ژنتیک، میکروبیولوژی، تشخیص طبی و … است. تجهیزات آزمایشگاهی مورد نیاز برای انجام این روش شمال ترنس ایلومیناتور، الکتروفورز، منبع تغذیه الکتروفورز است. رویان ایران، بزرگ ترین مرجع تخصصی فروش تجهیزات آزمایشگاهی، تمام تجهزات مصرفی و دستگاه های مورد نیاز ساترن بلاتینگ را با بهترین قیمت و کیفیت در اختیار پژوهشگران محترم قرار می دهد. برای استعلام قیمت و خرید محصولات با کارشناسان رویان ایران تماس حاصل نمایید.