الکتروفورز

الکتروفورز چیست

الکتروفورز (electrophoresis) روشی برای جداسازی ماکرومولکول ها ( مثل DNA , RNA و یا پروتئین ها) است. در این روش این مولکول ها در یک میدان الکتریکی قرار می گیرند و با توجه به اینکه تمامی آن ها دارای بار الکتریکی هستند، در این میدان بر اساس شکل فضایی، وزن و بار با سرعت های متفاوتی حرکت می کنند و در فضای مشخصی در فضای متخلل موجود ( مانند ژل آگاروز) قرار گرفته و بدین صورت از یکدیگر جدا می شوند.

جهت خرید و اطلاع از قیمت های بروز انواع الکتروفورز با کارشناسان ما در مجموعه رویان ایران تماس بگیرید.

 شماره تماس: 6417 814 0912

نتایج جداسازی با این روش بسته به اندازه و اختلاف وزنی که مولکول ها با یکدیگر  دارند و میزان ولتاژی که اعمال می شود و زمان الکتروفورز متفاوت خواهد بود. در صورتی که مدت زمان عمل الکتروفورز کم باشد روی هم افتادن باندها و نیز اسمیرهای غیر قابل تمایز مشاهده خواهد شد. همچنین اگر مدت زمان الکتروفورز زیاد از حد باشد ممکن است مولکول ها از ژل خارج شوند.

 تجهیزات الکتروفورز

سیستم های ژل الکتروفورز:

این سیستم شامل ظروف و قاب های ساخت ژل و بافر، الکترود ها و سیستم اتصال و مولد الکتریکی می باشد. علاوه بر این در مواردی از خشک کن مخصوص ژل نیز استفاده می شود که استفاده از آن بستگی به نوع آزمایش و ژل مصرفی دارد.

تانک بافر و قاب ساخت ژل: این ظروف معمولا شفاف و دارای قابلیت عبور دادن UV هستند. از آنجا که برای انجام ژل الکتروفورز بایستی ژل با محلول بافر کاملا پوشیده باشد، از ظروفی که به آن سینی، تانک یا تری بافر گفته می شود برای قرار دادن ژل استفاده می گردد.

این ظروف دارای محل هایی برای اتصال به الکترود ها و همچنین دارای شیار ها و پیچ هایی برای ثابت نگه داشتن ژل می باشند. این تانک ها می توانند افقی یا عمودی باشند. تانک های افقی برای نمونه های تعداد بالا و تانک های عمودی برای ژل های ستونی با نمونه های کمتر قابل استفاده هستند.

از دیگر مزایای  تانک های افقی این است که حرارت تولید شده در هنگام واکنش را به صورت یکنواخت در تمامی سطوح ژل پخش می کنند و در نتیجه از جمع شدن و تغییر شکل ژل و جا به جایی خطوط حاصل از انتقال مولکول ها جلوگیری می نماید.

در بعضی موارد ظرف بافر با جا به جایی دیواره های قاب ساخت ژل به وجود می آید، در این موارد بایستی توجه داشت که به هنگام بستن قسمت های مختلف تانک از نشتی و ترک خوردن ژل جلوگیری شود.

قاب ژل الکتروفورز

برای ساختن ژل از قاب های متفاوتی استفاده می شود، که بایستی نوع و اندازه آن را با توجه به ظرف بافر و تعداد نمونه ها انتخاب کرد. این قاب ها شامل یک چهارچوب شیشه ای بی رنگ و شانه های چاهک ساز ریز یا درشت هستند.

ابتدا بایستی محلول ژل را ساخته و در این قاب ها ریخت و سپس شانه های چاهک ساز را با توجه به اینکه الکتروفورز عمودی یا افقی است درون ژل قرار داد. پس از آن بایستی مدت زمانی را برای پلیمری شدن و بستن ژل در نظر گرفت. اگر زودتر از این زمان شانه ها را خارج کنیم، چاهک ها به درستی تشکیل نخواهند شد.

الکتروفورز معمولاً در جعبه ای انجام می شود که در انتهای آن بار مثبت و در انتهای دیگر بار منفی داشته باشد. و همانطور که همه ما در فیزیک پایه آموخته ایم ، هنگامی که شما یک مولکول باردار را در محیطی مانند آن قرار می دهید ، مولکول های منفی به سمت بار مثبت می روند و بالعکس.

در موردDNA  که یک مولکول بسیار طولانی است ، شما نمی خواهید در اکثر موارد ، یک مولکول DNA کامل از یک سلول را روی ژل اجرا کنید. DNA  آنقدر بزرگ است که هرگز به ژل وارد نمی شود ، بنابراین آنچه دانشمندان انجام می دهند و آنچه که مردم این روزها در کلاس های درس انجام می دهند ، خرد کردن DNA  با استفاده از مواردی مانند آنزیم های کتیبه ای است که DNA را به قطعات قابل کنترل تری در حالت قابل تکرار و سپس این قطعات ، بسته به اندازه قطعات ، کم و بیش به داخل ژل در الکتروفورز از بالا به پایین حرکت می کنند.

انواع الکتروفورز

انواع مختلفی از ژل ها معمولاً به عنوان محیط پشتیبانی الکتروفورز استفاده می شوند و بسته به اینکه کدام یک مفیدتر باشد ممکن است به شکل صفحه یا لوله باشد.

صفحات ژل امکان اجرای همزمان بسیاری از نمونه ها را فراهم می کنند و به همین دلیل اغلب در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار می گیرند. با این حال ، ژل های لوله ای تفکیک بهتری از نتایج را ارائه می دهند ، بنابراین اغلب برای الکتروفورز پروتئین انتخاب می شوند.

ژل آگارز معمولاً برای الکتروفورز DNA استفاده می شود. این یک ساختار منافذ بزرگ است که به مولکول های بزرگتر اجازه می دهد تا به راحتی حرکت کنند اما برای توالی مولکول های کوچکتر مناسب نیست.

الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) وضوح بیشتری نسبت به ژل آگارز دارد و آن را برای تجزیه و تحلیل کمی مناسب تر می کند. این امر امکان شناسایی چگونگی اتصال پروتئین به DNA را فراهم می کند. همچنین می تواند برای درک چگونگی مقاومت باکتریها در برابر آنتی بیوتیک ها از طریق تجزیه و تحلیل پلاسمیدها مورد استفاده قرار گیرد.

الکتروفورز D2 مولکول ها را در امتداد یک محور x و یک محور y جدا می کند – یکی از آنها را با بار و دیگری را با اندازه جدا می کند.

چگونه قطعات DNA از طریق ژل حرکت می کنند؟

هنگامی که ژل در الکتروفورز قرار گرفت ، هر یک از نمونه های DNA که می خواهیم بررسی کنیم (به عنوان مثال ، هر واکنش PCR یا هر پلاسمید هضم شده با محدودیت) با دقت به یکی از چاه ها منتقل می شود. یک چاه مخصوص نردبان DNA است ، یک مرجع استاندارد که شامل قطعات DNA با طول مشخص است. نردبان های تجاری DNA در اندازه های مختلفی قرار دارند ، بنابراین ما می خواهیم یکی از “پوشش” خوب دامنه اندازه قطعات مورد انتظار خود را انتخاب کنیم.

بعد ، برق جعبه ژل روشن می شود و جریان از طریق ژل شروع می شود. مولکول های DNA به دلیل وجود گروه های فسفات در ستون فقرات قند-فسفات ، بار منفی دارند ، بنابراین آنها از طریق ماتریس ژل به سمت قطب مثبت حرکت می کنند. هنگامی که برق روشن شده و جریان از ژل عبور می کند ، گفته می شود که ژل در حال کار است.

مراحل اجرای الکتروفورز:

نمونه های DNA در انتهای الکترود منفی ژل در چاه ها بارگیری می شوند.

برق روشن شده و قطعات DNA از طریق ژل (به سمت الکترود مثبت) مهاجرت می کنند.

پس از اجرای ژل ، قطعات متناسب با اندازه از هم جدا می شوند. بزرگترین قطعات نزدیک بالای ژل هستند (الکترود منفی ، جایی که آنها شروع شده اند) و کوچکترین قطعات نزدیک قسمت پایین (الکترود مثبت) هستند.

منبع : رویان ایران | بزرگترین مرجع تخصصی تجهیزات آزمایشگاهی کشور