ترمال سایکلر thermal cycler

ترمال سایکلر گرادیانت و ساده (Thermal cycler)

معرفی ترموسایکلر

ترموسایکلر که به آن ترمال سایکلر (thermal cycler) یا ماشین PCR نیز گفته می شود، دستگاهی است که از آن  برای انجام PCR (polymerase chain reaction) یا واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده می شود. طی این واکنش از  قطعات DNA یا RNA کپی های زیاد در زمان کم تولید می شود. این واکنش در سه مرحله دمایی/زمانی به شرح زیر صورت می پذیرد:

1-واسرشت (Denaturation):

در این مرحله در مدت زمان 20 الی 30 ثانیه و دمای 94 الی 98 درجه، رشته های DNA و پرایمر از هم گسسته می شوند و تک رشته های DNA به وجود می آیند.

2-اتصال(Annealing):

در مرحله اتصال دمای محلول به مدت 20 الی 40 ثانیه به 30 تا 65 درجه ( با توجه به نوع آزمایش و نمونه) کاهش پیدا می کند. در این مرحله پرایمر ها به رشته های DNA الگو متصل می شوند.

3-طویل شدن یا پلیمریزاسیون(Extension/Elongation or polymerization):

در این مرحله آنزیم DNAپلیمراز (DNA polymerase) به هیبرید پرایمر و DNA متصل میشوند و با استفاده از نوکلوتید های آزاد موجود در محلول رشته مکمل DNA الگو را می سازد. در این مرحله دمای محلول که در واقع دمای اپتیمم برای عملکرد آنزیم DNAپلیمراز است 75 الی 80 درجه است.

در دستگاه ترموسایکلر واکنش سه مرحله ای فوق به تعداد دفعات دلخواه صورت می پذیرد و تعداد DNA های موجود در نمونه به صورت تصاعدی و با فرمول 2n افزایش می یابد. این دستگاه با دارا بودن قابلیت تنظیم دما و زمان تمامی مراحل واکنش زنجیره پلیمراز را با دقت انجام می دهد.

ازجمله کاربرد های PCRمی توان به تشخيص بيماري‌هاي قبل از تولد، تعيين جنسيت جنين، تشخیص بیماری ها، تشخیص سرطان و بررسی مراحل درمان آن، شناسائی میکروارگانیسم هایی که قابل کشت نیستند و یا سرعت رشد آنها در محیط کشت خیلی کند است،  تحقیقات جنایی، انگشت نگاری ژنتیکی، بررسی DNA قدیمی، جداسازی DNAژنومی، تعیین توالی DNA، کلونینگ و بررسی موقعیت ژن ها بر رویDNA اشاره کرد.

ترمال سایکلر ساده

ترمال سایکلر استاندارد یا ساده یک دستگاه پایه برای ایجاد دوره های دمایی لازم برای انجام مراحل مختلف واکنش های PCR است. این دستگاه معمولا به گونه ای طراحی می شود که ویال ها و لوله های کوچک را در خود جای دهد و قابلیت تنظیمات اتوماتیک دما و  زمان و تعداد دفعات انجام آزمایش را نیز داشته باشد.یکی از مهم ترین ویژگی هایی که در انتخاب این دستگاه بایستی به آن توجه شود سرعت در تغییرات دمایی یا ایجاد رمپ های دمایی در فواصل بین مراحل واکنش است.سرعت این تغییرات که به نوع سیستم حرارتی، بلوک حرارتی و سینک حرارتی دستگاه بستگی دارد عموما 5 تا 6 درجه سانتی گراد در ثانیه می باشد.این  ترموسایکلر ها  در سایزها و اشکال متفاوت با توجه به تعداد نمونه، نوع نمونه، نیاز به سرعت در جوابدهی و… ساخته شده است و از آنها در آزمایشگاه های سلولی و مولکولی، تحقیقات بیولوژیک، میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی، ژنتیک و … استفاده می شود.

 

ترمال سایکلر گرادیانت

در این نوع ترمال سایکلرها دمای بخش های مختلف یک بلوک حاوی ویال های کوچک به صورت جداگانه قابل تنظیم است. از این ویژگی برای تعیین دمای مناسب اتصال پرایمر ها و یا پیدا کردن دمایی که واکنش در آن بیشترین و بهترین نتیجه را خواهد داشت استفاده می شود. همچنین از دیگر مزایای ترموسایکلر گرادیانت انجام آزمایشات متفاوت در یک ران کاری است زیرا می توان دمای قسمت های مختلف یک بلوک حرارتی را با دما های متفاوت تنظیم کرد.

اجزای سازنده ترمال سایکلر

• منبع حرارتی ترموالکتریکی: این منبع با استفاده از جریان الکتریکی، حرارت را به صورت یک طرفه و بر خلاف شیب دمایی طبیعی (از قسمت سرد به گرم) منتقل می کند، به این سیستم پلتیر گفته می شود. این سیستم شامل سینک های حرارتی، سنسور و فن می باشد که در تماس با بلوک های حرارتی نگهدارنده قرار گرفته اند و توسط بورد الکتریکی دستگاه کنترل می شوند. این نوع منبع حرارتی دارای دو سطح جذب و پخش دما است و می تواند به سرعت دما را تغییر دهد. این ویژگی ( سرعت در تغییر دما) برای بهینه سازی نتایج حاصل از واکنش PCR بسیار مفید بوده و زمان واکنش را به میزان قابل توجهی کاهش می دهد.
• بلوک نگهدارنده: این بلوک ها که جایگاه قرار گرفتن میکرو تیوب ها یا ویال های آزمایشی هستند در اشکال و ظرفیت های گوناگون ساخته می شوند. در بعضی دستگاه ها این بلوک ها قابل تعویض بوده تا کاربران بتوانند آزمایشات مختلف را در احجام و تعداد متفاوت انجام بدهند. در بعضی دستگاه ها چندین بلوک با قابلیت تنظیم جداگانه برای انجام واکنش های متفاوت به صورت هم زمان تعبیه شده است. در صورتی که آزمایش مورد نظر نیاز به تغییرات دمایی سریع باشد، بلوک حرارتی از جنس نقره به دلیل خاصیت این فلز در تغییر سریع دما و همچنین پخش دمای یکنواخت مناسب تر است.
• درب دارای المنت حرارتی: در گذشته از روغن های معدنی برای جلوگیری از تبخیر و یا جمع شدن مایع موجود در درب لوله ها استفاده می شد، امروزه این المنت های حرارتی که در درب دستگاه ترموسایکلر قرار گرفته است این کار را انجام می دهد. در این روش خطر به وجود آمدن خطا در نتایج به دلیل مخلوط شدن روغن با نمونه و هدر رفتن نمونه هنگام جداسازی وجود نخواهد داشت. علاوه بر این از تقطیر و تبخیر نمونه ها که منجر به غلیظ شدن نمونه و در نتیجه خطا در نتایج می شود نیز جلوگیری خواهد شد. این درب دارای قفل های دستی و یا اتوماتیک است که به هنگام شروع آزمایش از باز شدن و ایجاد تغییرات دمایی نا خواسته جلوگیری کنند.
• منبع تغذیه و بورد الکتریکی: منبع تغذیه دستگاه برق شهری است و با انتقال انرژی الکتریکی به بخش های مختلف دستگاه انرژی لازم برای عملکرد آنها را تامین می کند. بورد الکتریکی دستگاه نیز مانند یک موتور کارهای دیجیتال و کنترل دوره های دمایی/ زمانی، عملکرد سینک و المنت های حرارتی و… را به صورت برنامه هایی در خود ذخیره کرده و کنترل می کند. برنامه ریزی بورد الکتریکی می تواند به صورت ثابت در هنگام ساخت و یا به صورت متغیر توسط صفحه دیجیتال موجود بر روی دستگاه یا به صورت برنامه های موجود  در یو اس پی و یا توسط کامپیوتری که دستگاه به آن متصل است صورت پذیرد.

روش کار ترمال سایکلر

با توجه به نوع دستگاه، دستور العمل شرکت سازنده، هدف از انجام آزمایش و … روش کار و برنامه ریزی دستگاه ها متفاوت است، اما به طور کلی می توان مراحل کار با ترموسایکلر به صورت زیر شرح داد:

• ابتدا محل قرار گیری دستگاه را مشخص نمایید. با توجه به اندازه دستگاه بایستی فضای لازم برای باز و بسته شدن درب و تجهیزات الکتریکی در نظر گرفته شود.
• پس از متصل کردن ترموسایکلر به برق و روشن کردن دستگاه، از طریق سیستم برنامه ریزی که بر روی دستگاه تعبیه شده و یا به صورت کامپیوتر یا یو اس پی در اختیار دستگاه قرار داده می شود را مشخص کنید. این برنامه ریزی شامل دوره های دمایی، تعداد دفعات تکرار واکنش، الگو های دمای متغیر در نقاط مختلف بلوک حرارتی (در ترموسایکلر گرادیانت) می شود.
• در بعضی از دستگاه ها قبل از شروع کار بایستی میکروتیوب ها در دستگاه قرار داده شده و درب دستگاه قفل شود. در سایر دستگاه ها بعد از مشخص نموده برنامه، زمان محدودی برای قرار دادن نمونه ها در دستگاه در اختیار کاربر قرار داده می شود و سپس درب به صورت اتوماتیک قفل می شود.
• پس از پایان واکنش اصلی، مدت زمانی با دمای 75 الی 80 درجه در نظر گرفته می شود تا همانند سازی DNAها تا ماکسیمم حد ممکن صورت پذیرد و سپس دستگاه پایان واکنش را اعلام میکند.
• در پایان نمونه ها را از دستگاه خارج کرده، دستگاه را به منوی اصلی برگردانده و خاموش کنید و سپس از برق بکشید.

نگهداری و ایمنی ترموسایکلر

• محل قرار گیری دستگاه نباید در معرض نور مستقیم خورشید، حرارت، امکان ضربه و سقوط باشد.
• در دستگاه هایی که قفل درب در آنها آنالوگ است، از پیچاندن زیاد قفل خودداری نمایید، زیرا این امر باعث چسبیدن قسمت داخلی پیچ با محل قرار گیری نمونه می شود، که نهایتا باعث افزایش بیش از حد دما در آنها شده ( زیرا قسمت داخلی پیچ فلزی و رسانای گرما است)و باعث آسیب دیدن نمونه می شود.
• تنظیمات دستگاه ها توسط کارشناسان آموزش دیده صورت می گیرد، لذا از تغییرات آنها جدا خودداری نموده و همچنین پس از پایان کار، دستگاه را به منوی اصلی برگردانید، زیرا عموما دستگاه ها دارای حافظه هستند و پس از روشن شدن، در صورت وجود برنامه قبلی با همان برنامه شروع به کار میکنند.
• از قرار دادن مستقیم نمونه ها در چاهک های بلوک حرارتی جدا خودداری نمایید و از میکروتیوب یا دیسک های حاوی ویال استفاده نمایید.
• برای انجام آزمایشات دو فضای جدا گانه تمیز و آلوده برای کار مشخص نمایید، در موارد ایده ال دو اتاق جداگانه در نظر گرفته می شود. و کارهای pre-PCR و post-PCR را به صورت یک طرفه از قسمت تمیز به سمت قسمت آلوده انجام دهید تا از آلودگی نمونه و محیط جلوگیری شود.

کنترل کیفی و مراقبت های دوره ای ترموسایکلر

کنترل کیفی این دستگاه و کالیبراسیون آن توسط تکنسین های آموزش دیده و یا شرکت های سازنده و یا وارد کننده صورت می پذیرد. موارد زیر بایستی در کنترل کیفی ها لحاظ شود:

• دستگاه از نظر حرارتی باید کنترل شود( از لحاظ صحت و دقت تنظیم دما و یکنواختی آن در سرتاسر بلوک حرارتی)
• سیستم های سخت افزاری و نرم افزای دستگاه و سنسور ها به درستی عمل کنند و قابلیت انجام تست های مربوطه را داشته باشند.

لازم است که تمامی تجهیزات و امکانات کنترل و کالیبراسیون ترموسایکلر در آزمایشگاه شرکت تولید کننده یا وارد کننده و یا شرکت ارائه دهنده خدمات فنی پس از فروش موجود باشد.

کاربران بایستی گزارش های مربوط به کنترل کالیبراسیون دوره ای را بایگانی کرده و در صورت بروز خطا یا خرابی به مسئول و شرکت مربوطه اطلاع دهند.

منبع : رویان ایران | بزرگترین مرجع تخصصی تجهیزات آزمایشگاهی کشور